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茶籽饼粕营养丰富,是潜力很大的饲料资源
但茶籽饼粕含有茶皂素,对动物机体有很大毒害
作用本文针对茶皂素,对现有的主要检测检验方
法综述如下
1 茶皂甙的分析方法
1.1 重量法
朱全芬等(1983)从糖体,配基两方面着手测
定,对比出以其配基含量为基础的定量法较宜茶
皂甙能与铅钡盐等作用产生沉淀,形成复盐,沉
淀剂的选择以碱式醋酸铅为好,其测定值稳定,干
扰少,误差范围小,重演性强 复盐在酸性条件下
又重新解离出金属离子和茶皂甙 除去金属离子
后,茶皂甙在强酸条件下水解,糖体被水解,获得
不溶于水的茶皂苷元 由茶皂苷元的含量可求得
茶皂甙的含量 该法涉及到换算系数的问题,即
100g茶皂苷元相当于多少克茶皂甙理论上,一个
分子的茶皂甙水解可以得到一个分子的茶皂苷
元,但是茶皂甙是一类混合物,配基结构有多种,
因此,不同研究者对于茶皂甙分子量的测定值略
有出入;茶皂甙中有机酸类也能发生上述反应,其
结果的准确度亦受水解条件的制约;另外,该法虽
测定数值稳定重演性强等优点,但分析时间长,
操作繁复,难以满足工业分析的需要
1.2 比色法
比色法是利用三萜类皂苷的显色反应,选择
一种线性关系良好的显色剂,反应后用分光光度
计测吸光度,用对照品皂甙的标准工作曲线定量
常用的显色剂有间苯三酚- 乙醇溶液 苯酚- 硫
酸香草醛- 浓硫酸对- 二甲氨基苯甲醛三氯
化铁- 浓硫酸法等 研究表明,比色法消耗试剂
少,操作简便,分析快,重现性及准确度也较好,适
用于工业分析
1.2.1间苯三酚法(皂甙糖体定量分析法)
该法基于测定水解前后糖含量之差,间接定
量皂甙的含量 戊糖与己糖在非含氧酸存在的酸
性条件下可转化成糖醛,糖醛进一步可与间苯三
酚作用形成有色物质,色泽强度与糖分含量呈一
定相关性样品中除了茶皂素以外,尚有寡糖和多
糖存在,选用溶剂法提取茶皂素以排除多糖的干
扰,再用碱式醋酸铅除去供试液中的茶皂素,测定
出其他糖分的含量,与供试液中总糖分测定值之
差,计算出茶皂素的含量
该法适用于实验室研究和工业分析中茶皂甙
含量的测定,操作简便快速,消耗试剂量少,重现
性强此法不仅能用于茶籽中茶皂素的定量分析,
亦适用于已知糖分种类的糖体定量分析 与重量
法相比,2种方法都比较稳定,但间苯三酚法测定
结果略高,且分析一个样品,间苯三酚法一般只需
1个工作日,重量法至少需要3个工作日
1.2.2苯酚- 硫酸法
单糖或低聚糖在浓硫酸作用下迅速脱水生成
糠醛衍生物,与苯酚缩合成有色物质,其呈色与浓
度呈线性关系,据此测定糖含量,从而间接测定皂
甙的含量 岛田和子采用固相萃取柱的前处理方
式,将茶叶浸出液加入到Sep- Pak C18固体萃取
柱,先用蒸馏水洗去水溶性的单宁,再用浓度20%
的甲醇洗去儿茶素,最后用浓度80%的甲醇洗提
得到含皂甙的甲醇溶液,真空干燥下浓缩得到茶
皂素的粗品,测定了GyokuroMatchaSenchaHojicha和Bancha的浸出液中茶皂甙的含量,并指出
Gyokuro中的皂甙含量最高Mukai等也用该法对
茶籽中的皂甙进行了测定
1.2.3香草醛- 硫酸法
香草醛- 硫酸法反应机理可能是皂甙在强氧
化性酸作用下脱氢,氧化后再与香草醛加成生成
有色物质该方法具有操作流程短,方法简便可行
等优点 朱全芬等,傅春玲等指出以8%的香草醛
- 乙醇溶液和77%硫酸为显色剂,测定波长为
2.5nm,显色反应温度为60 ,反应时间为
15min为宜,线性范围为0- 20 g/ml
该法与间苯三酚法相比较,反应灵敏,显色相
对稳定,反应条件容易控制,但试剂消耗量大,操
作流程长,被测样品需要经过初步纯化间苯三酚
法测定结果稍高,可能是由于部分多糖类未被完
全除去造成的 香草醛- 浓H2SO4显色法是最常
用的皂苷定量方法, 实验结果表明它具有反应灵
敏, 操作相对简测糖定量法具有显色相对稳定,反
应条件容易控制,但试剂消耗量大,操作流程长,被
测样品需经过初步纯化等缺点
1.2.4对- 二甲氨基苯甲醛法
皂素与对二甲氨基苯甲醛在浓磷酸的乙醇溶
液显棕红色,且在一定浓度范围内符合比尔定律,
确定的最佳条件如下:显色剂加量为1mL3%对二
甲氨基苯甲醛乙醇溶液和1.5mL的浓磷酸,显色
反应温度70 ,反应时间15min,测定波长
525nm,本方法相对标准偏差(RSD%)为1.61%,平
均加标回收率X=99.44% 五环三萜的齐墩果烷结
构的皂甙类都能与对- 二甲氨基苯甲醛反应显
色,且色泽强度随皂甙浓度增加而增强利用这一
反应,用1%对- 二甲氨基苯甲醛与茶皂甙浸提液
加热显色,用H3PO4作稳定剂,在525nm进行测
定,用茶皂甙对照品作标准曲线,从而求出茶皂甙
的含量该法测量浓度范围为0- 100mg/ml 谭新东
等用该法分别对茶树的不同部位进行测定,指出
样品颗粒的粉碎程度对试验结果有较大影响;未
脱油的茶籽粉中含有约30%的粗脂肪,对茶籽粉
中茶皂甙的提取造成了困难,使测量结果偏低
1.2.4三氯化铁- 浓硫酸法
茶皂甙与三氯化铁(FeCl3)呈黄绿色的显色反
应,因此可用分光光度计测其吸光度,用对照品皂
苷的标准工作曲线定量 姜勤等采用该法,用D
型大孔树脂除去小分子糖氨基酸无机盐等水溶
性杂质及部分大分子色素等杂质后,用分光光度
计测定其吸光度,对茶皂甙进行了定量分析 刘晓
庚等认为植物样品中的酚类物质也能与FeCl3发
生类似的显色反应,直接用单波长分光光度法测
定时干扰严重 为此,其利用茶皂甙与FeCl3反应
之间的反应速率不同,进行速差分光光度法(或双
波长分光光度法等)测定,结果可以在二者不进行
分离的条件下直接测定样品中的茶皂甙含量,测
量浓度范围为0- 20mg/ml
1.3 荧光光度法
荧光光度法是基于茶皂甙对铝- 8- 羟基喹啉
的荧光有增敏作用,且在一定浓度范围内荧光相
对强度(F)随茶皂甙含量的变化而呈线性变化进
行测量 刘晓庚等考察了Na
+ K+
Cu
2+
Fe
3+
Fe
2+
NH
4+
Ma2+
Mg2+
Ca
2+
Zn
2+
Co
2+
M0 (Ⅳ)Cr
3+ 等常
见阳离子和Cl
- SO4
2-Br
- CO3
2- 等常见阴离子以
及蔗糖葡萄糖大豆蛋白胨等干扰剂的影响,在
干扰剂的浓度不超过试样中茶皂甙含量50倍时,
均不产生明显的干扰作用因此认为,在通常情况
下用该方法对茶皂甙进行测定时,无需对样品进
行特殊或分离处理便可直接测定,该法的线性范
围为0耀4.25mg/ml 用荧光光度法和速差分光光
度法测定茶皂甙的结果与重量法的测定结果十分
吻合,而且2种方法都具有相对标准差(RSD)小
重现性好灵敏度高测量浓度范围较宽回收率
也好等特点 荧光光度法与速差分光光度法相比
较,荧光法的重现性和灵敏度优于速差法,但荧光
法的回收率偏低,测量浓度范围稍小,更适合于微
量茶皂甙的测定
1.4 薄层扫描法
茶皂甙中皂甙虽是一系列结构极为相似的三
萜皂甙化合物,但在高效薄层色谱(HPTLC)板上
通常只显示一个斑点,在280nm附近有最大光吸
收,可以将对照品与之比较,利用薄层色谱扫描仪
进行定量,即可测定茶皂甙中皂甙类成分的含量
该法重现性好,回收率高,结果较准确,稳定性好,
即使没有薄层扫描仪,可以用碘显色,然后刮板分
离,待碘挥发后溶解在甲醇中,用紫外光谱测定
田世雄等用HPTLC(20cm 10cm),以正丁醇(用
水饱和):甲醇:吡啶=18:1:1为展开剂,测定了茶
皂甙含量 结果表明,薄层色谱分离样品,可除去
干扰成分,在不经显色的情况下,直接进行紫外扫
描,大大降低了皂甙测定误差,其测定值在数十小
时内无明显变化
1.5 溴酸钾法
溴对没有空间阻碍的碳- 碳双键加成反应很
快,故可以作为滴定反应的滴定剂茶皂甙的五环
三萜的糖苷配基上的19 有一具环己烯性质的
双键,有些与其成酯的酸间也有个双键,且均不呈
空间阻碍,因而可以溴酸钾作为滴定剂,以甲基橙
为指示剂,以溶液由橙红色变浅或消失作为滴定
终点来测定茶皂甙的含量 由于茶皂甙有些含1
个双键有些含2个双键,因此茶皂甙与溴加成的
n值需要通过对纯品测试结果来确定;另外,由于
干扰溴加成反应的影响因素较多,所以宜在测定
之前对试样加以预处理,排除干扰物
1.6 高效液相色谱法
高效液相色谱(HPLC)法具有高压高速高
效高灵敏度的特点,现已成为分离皂甙的常用方
法 由于茶皂甙结构的相似性和复杂性,目前
HPLC主要应用于茶皂甙的分离和纯化方面钟世
安等(2007)研究了用索氏提取器提取茶籽饼中茶
皂素,选择合适的最大吸收波长,排除了黄酮和单
宁酸的干扰,优化了色谱条件,建立了反相高效液
相色谱法测定茶皂素含量的方法:以RP- ODS
C18(150mm 4.6mm,5 m)作分析柱,以甲醇作茶
皂素溶液的溶剂和流动相,流速慢,控制在0.50
mLmin- 1,检测波长为280nm,以质量浓度为横坐
标,峰面积为纵坐标,得到工作曲线,其回归方程
为Y=3.54 106X+1.15 105,相关系数为0.9997
测得回收率在97.2 102.1 之间,相对标准偏
差(n=7)小于0.35 此法的试剂消耗量少,操作简
便,回收率高,相对标准偏差较小,精确度和准确
度高 刘新清采用该法对茶籽中的茶皂甙进行定
量分析,采用ODS- Hypersil柱,甲醇作流动相,在
215nm处进行检测 刘新清检测茶皂素采用
Hewlett Packard ODSHypersil5微米色谱柱,125
4毫米不锈钢柱,甲醇作流动相,0.5毫升/ 分流
速;检测波长215纳米,柱温为室温,茶皂素标准
品含量大于95% 结果表明,该法简便快捷重现
性好准确度高,适于茶皂甙含量的测定 谭博等
(2009)以VP- ODS(250mm 4.6mm,C18,5 m)
作分析柱,以甲醇- 水(v v=9 1)作流动相,流
速控制在1.0ml min,检测波长280nm,以质量浓
度为横坐标,峰面积为纵坐标,得到工作曲线为
Y=3.02 10
6X 1.16 10
4,线性相关系数为0.999
5 回收率为97.02% 102.82% 该法具有相对标
准偏差较小,精密度和回收率高,操作简便等优
点,是一种较好的分析方法采用该方法测得茶籽
饼中粗茶皂素的含量为11.89% 赵静娟等(2009)
采用Angilen,TC- C18, 25 m,250mm 4.6mm做
色谱柱检测波长为209nm,柱温: 25 ,用流动相
A:纯水;流动相B:乙腈进样5 L,运行25min 梯
度:0~10min 内流动相B由5%增至25%, 保持
14min后1min内回至5% 流速: 1mL/min 并比较
了)比较了香草醛浓硫酸显色定量法和HPLC定量
法,得出HPLC法可以对油茶皂苷进行更准确的定
量的结论
2 小结
目前,茶皂甙以其优越的表面活性以及生物
活性得到了广泛的应用由于皂甙结构的相似性
多样性以及复杂性,单体皂甙的分离工作一直是
茶皂甙研究中最主要的困难之一 尽管HPLC的
应用使得皂甙的研究工作发生了质的飞跃,现已
分离鉴定茶皂甙60 种左右,但是在进入HPLC
系统前经多次的萃取,多次的硅胶柱,操作繁琐且
一定程度上造成了重复性差等问题,因此,对茶皂
甙单体的定量分析还有待于分离条件的进一步提
高 另外,也还有许多的问题有待于进一步的研
究,如茶皂甙总量的测定方法各有优缺点,没有一
种标准的方法;茶皂甙标准品难寻,且现有的标准
品大多为混合物,不同品种的茶 不同工艺得到的
标准品有一定的差异等
试验研究
- 王木生
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茶粕是一种营养价值较高的潜在性饲料原料。然而茶粕里含有高达10%-15%的茶皂素,对高等动物具有一定的毒性,但研究表明,适量的茶皂素对动物的生长有促进作用。并能提高机体免疫力。为了使用的安全性和利用率,对脱毒茶粕残留茶皂素含量要进行测定。方法主要有分光光度法和利用茶皂素的鱼毒作用。